李俊 牛志强 侯博 华利忠 韦艳娜 刘蓓蓓 王丽 谢星 张珍珍 熊祺琰 邵国青 李新国 冯志新

摘要：2018年自福建省疑似鸡滑液囊支原体感染病鸡中分离得到9株鸡滑液囊支原体，采用微量肉汤稀释法测定了其对9种抗菌药物的敏感性，对筛选出的多重耐药株（MS HB）进行了全基因组序列分析。结果显示，福建地区鸡滑液囊支原体临床株对泰万菌素和泰妙菌素较为敏感，对泰乐菌素、多西环素、土霉素和替米考星敏感性次之，而对氟苯尼考和恩诺沙星最不敏感。多重耐药株（MS HB）基因组大小为766 081 bp;GC含量为28.02%;共注释到1 464个基因，其中，包括多个毒力基因和1个耐药基因（ermQ），与敏感标准株WVU1853全基因组序列比对得出大环内酯类和氟喹诺酮类药物耐药基因的多个突变位点。研究结果丰富了对鸡滑液囊支原体流行病学的认识，并可为该地区临床治疗鸡滑液囊支原体感染的合理用药选择提供理论依据和实践指导。

关键词：鸡滑液囊支原体;药物敏感性;全基因组测序分析

中图分类号：
S859.7文献标志码：
A

文章编号：1002-1302（2021）12-0117-07

收稿日期：2020-10-07

基金项目：国家自然科学基金（编号：31800161、31900159）;江苏省自然科学基金（编号：BK20190261、BK20180297）。

作者简介：李 俊（1987—），女，安徽马鞍山人，博士，助理研究员，主要从事动物支原体耐药机制研究。E-mail：lijunjaas@126.com。

通信作者：李新国，硕士，兽医师，主要从事兽医药理研究及临床技术服务工作，E-mail：57740190@qq.com;冯志新，研究员，博士生导师，主要从事动物传染病研究，E-mail：fzxjaas@163.com。

鸡滑液囊支原体是一种无细胞壁的病原微生物，给养禽业造成严重的经济损失，可引起鸡和火鸡的关节滑膜炎、呼吸系统疾病，蛋鸡产蛋量下降、孵化率降低，肉鸡饲料转化率降低、胴体废弃率升高等不同严重程度的亚临床至临床症状，也可能与其他病原（如传染性支气管炎、新城疫病毒、流感病毒、大肠杆菌和其他支原体等）合并继发感染，或因饲养管理不善而加重病情[1]。

临床防控鸡滑液囊支原体感染主要依靠疫苗免疫和药物治疗。疫苗免疫主要用于长期防控，而药物治疗是最快速有效降低经济损失的途径。大环内酯类、氟喹诺酮类和四环素类是临床治疗畜禽支原体感染最常用的药物类别，但是在抗菌药物长期大量使用的选择性压力下，耐药菌株相关报道屡见不鲜[2]，造成临床治疗效果下降。本研究采用微量肉汤稀释法测定了福建地区分离的鸡滑液囊支原体对兽医临床常用抗菌药物的敏感性，得到其流行病学特征，并对多重耐药株的全基因组序列进行分析，以期为临床谨慎合理选择与使用抗菌药物、遏制耐药性产生提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 临床病料的采集

2018年3—5月对福建省不同地区疑似鸡滑液囊支原体感染病鸡采集气管拭子，置于KM2液体培养基中4 ℃保存，送往实验室进行鸡滑液囊支原体的分离培养与鉴定。参考菌株鸡滑液囊支原体WVU 1853株受赠于江苏省农业科学院兽医所张小飞研究员。

1.1.2 培养基

KM2液体与固体培养基，由江苏省农业科学院兽医研究所猪病防控研究室提供。

1.1.3 抗菌药物

牧乐兴，中牧南京动物药业有限公司产品（2 500万U，批号：190227001）;酒石酸泰万菌素，内蒙古中牧生物药业有限公司（882 U/mg，批号：AY 201807028）;酒石酸泰乐菌素，山东鲁抗舍里乐药业有限公司（939 U/mg，批号：T-1709143）;延胡索酸泰妙菌素，山东胜利生物工程有限公司（80%，批号：TMP801903101）;替米考星，山东鲁抗舍里乐药业有限公司（93.6%，批号：TMCZ1905044）;盐酸多西环素，扬州联博药业有限公司（90.4%，批号：YD 190401108）;盐酸土霉素，扬州联博药业有限公司（90.6%，批号：YT 190402054）;氟苯尼考，山东国邦药业股份有限公司（100%，批号：701-1904090）;恩诺沙星，浙江国邦药业有限公司（99.9%，批号：190917-5）。

1.2 方法

1.2.1 鸡滑液囊支原体的分离

病料拭子在KM2液体培养基中经剧烈振荡，取上清悬液经0.45 μm的滤器过滤，置于无菌的密闭培养管，37 ℃培养 18～20 h后，以1 ∶10转移接种至新鲜KM2液体培养基中，37 ℃继续培养14 d，逐日观察培养基颜色变化，待颜色由玫瑰红变为橘红色或黄色时，再次以1 ∶10接种新鲜培养基进行传代。待临床分离株稳定传至3～4代，倍比稀释后采用KM2固体培养基进行克隆纯化2次，在体视显微镜下观察菌落形态。

1.2.2 鸡滑液囊支原体的PCR鉴定

自KM2固体培养基挑取单个疑似菌落至2 mL的KM2液体培养基中，待培养成熟后，采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取疑似鸡滑液囊支原体菌株的DNA作为模板进行PCR及序列测定。采用OIE推荐的鸡滑液囊支原体检測引物（MS-F：5′-GAGAAGCAAAATAGTGATATCA-3′，MS-R：5′-CAGTCGTCTCCGAAGTTAACAA-3′），预期扩增片段为185 bp。具体PCR扩增条件参考中华人民共和国农业行业标准《禽支原体PCR检测方法NY/T 553—2015》。

1.2.3 抗菌药物对鸡滑液囊支原体的最小抑菌浓度测定

参考Hannan推荐的微量稀释法测定抗菌药物对鸡滑液囊支原体临床分离株的最小抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC）[3]。称取待试药物，无菌操作溶解于相应稀释液，配制母液浓度为1 280 μg/mL，将各药物母液用KM2液体培养基按照2倍稀释法稀释成10个工作液浓度。根据不同分离株的颜色变化单位（CCU）调整菌液接种量至104～105 CCU/mL。在96孔细胞微孔板中进行MIC测定。设置WVU 1853为质控菌株，KM2液体培养基为阴性对照，菌株培养液为阳性对照，同时各MIC试验设置3个平行。将96孔细胞微孔板密封后至于37 ℃、5% CO2培养箱中静置培养，逐日观察颜色变化，记录初始MIC值与终末MIC值。判定标准为阴性对照孔不变色，阳性对照孔变为黄色，以试验孔不发生肉眼可见颜色变化的最低药物浓度孔为该药物对该菌株的MIC。

1.2.4 鸡滑液囊支原体耐药株全基因组序列分析

对于呈现多重耐药表型的鸡滑液囊支原体MS HB株，提取其全基因组DNA采用Illumina PE150平台进行测序，具体工作交由北京诺禾致源科技股份有限公司完成。简要测序步骤如下：应用Illumina Nova Seq PE150技术对构建的PE文库（～350 bp）文库测序。对于原始下机数据使用readf（Version 10）进行过滤，得到有效数据，采用SOAP denovo（Version 2.04）、SPAdes、ABySS软件进行基因组组装，并最终使用CISA软件进行整合，采用gapclose（Version1.12）对初步组装结果进行优化和补洞。

使用GeneMarkS（Version 4.17）软件对新测序的基因组进行编码基因预测，对预测基因进行COG功能分类、GO注释、KEGG通路分析。利用tRNAscan-SE、rRNAmmer和Rfam database软件对tRNA、rRNA和sRNA进行预测，IslandPath-DIOMB（Version 0.2）软件对基因岛进行预测，phiSpy软件（Version 2.3）对前噬菌体进行预测，CRISPRdigger（Version 1.0）对CRISPR进行预测。使用TCDB（Transporter Classification Database）数据库分析转运蛋白，VFDB（Virulence Factors of Pathogenic Bacteria）数据库分析毒力基因，ARDB（Antibiotic Resistance Genes Database）数据库分析耐药基因，对比对得到的靶点突变设计引物进行PCR，结合桑格尔测序验证。

2 结果与分析

2.1 鸡滑液囊支原体的分离鉴定结果

经实验室分离纯化培养、分子生物学鉴定程序，自福建地区病鸡气管拭子样品中成功分离得到9株鸡滑液囊支原体，由图1-A可知，其KM2液体培养物呈紫红色，轻微振荡，有丝状或絮状物悬浮。鸡滑液囊支原体在KM2固体培养基上生长7～14 d，肉眼观察可见无色、透明、细小、圆形菌落。由图1-B可知，体视显微镜下低倍（40×）观察可见典型“油煎蛋”状特征，光滑扁平、边缘整齐、菌落中央致密隆起。

对于平板克隆后的鸡滑液囊支原体疑似菌株，试剂盒法提取其DNA，采用OIE推荐的鸡滑液囊支原体检测引物进行PCR扩增鉴定。由图2可知，测试菌株均成功扩增出特异性条带，长度为185 bp，与阳性对照WVU1853株一致，表明疑似菌株均可判定为鸡滑液囊支原体。

2.2 MIC测定结果

鸡滑液囊支原体临床分离株（9株）与标准株（1株）对牧乐兴等9种常用抗菌药物的敏感性测定结果见表1。由表1可知，牧乐兴与泰万菌素对所

有MS菌株的MIC测定结果较为一致。多数鸡滑液囊支原体临床株对泰万菌素、泰妙菌素较为敏感，对泰乐菌素、多西环素、土霉素和替米考星敏感性次之，对氟苯尼考和恩诺沙星最不敏感。其中，多种抗菌药物对MS HB株的MIC值均较高，提示MS HB株可能为多重耐药支原体。

2.3 MS HB株全基因组序列分析结果

将多重耐药MS HB株通过Illumina PE150平台进行全基因组测序，经序列组装和整合优化分析，其基因组基本信息见表2。由表2可知，HB株基因组总长度为766 081 bp，GC含量28.02%，N50长度为 83 641 bp，N90长度为14 900 bp，最长片段为 115 534 bp，最短片段为512 bp。由图3可知，注释后总共有1 464个编码基因，基因总长度为 516 525 bp，占基因组全长的67.42%，平均长度为353 bp。基因组含有34个tRNA编码基因， 3个5SrRNA，1个16SrRNA和1个23SrRNA。由圖4可知，基因岛是与病原机理、生物体的适应性等多种生物功能相关的基因组区段，共预测到2个基因岛。

由图5可知，对预测基因进行COG功能分类，共有235个基因被分为18种COG分类;由图6可知，共有2 875个基因注释上42条GO功能分类，样本基因的功能在生理过程分类中主要聚集于细胞进程（413个）和代谢过程（405个）;在分子功能主要聚集于结合（341个）和催化活性（373个）。由图7可知，对基因进行KEGG注释，561个基因共注释上90个通路，最多见的4个注释通路分别是代谢通路（89个）、核糖体（43个）、次级代谢产物生物合成（27个）和多样环境中的微生物代谢（27个）。

通过与细菌致病毒力因子数据库（VFDB）比对，MS HB株基因组共注释到9个毒力相关基因，主要包括dnaK、cylA、EF-Tu、lplA1、SSU98、oppF、pdhB、vlh和GAPDH等，具体注释见表3。

通过ARDB数据库注释，MS HB株基因组中注释到1个耐药基因ermQ，该耐药基因的基因序列编号为：GM000161。将MS HB株的大环内酯类耐药基因：23S rRNA基因（rrlA和rrlB）、L4核糖体蛋白编码基因（rplD）、L22核糖体蛋白编码基因（rplV）以及氟喹诺酮类药物靶点：DNA旋转酶编码基因（gyrA和gyrB）和拓扑异构酶IV编码基因（parC和parE）与GenBank中已公布全基因组序列的MS WVU1853株（登录号：NZ CP011096）进行比对，获得其基因突变位点与相应氨基酸突变位点，由表4可知，这些基因突变可能导致药物作用靶位改变，与抗生素亲和力下降，从而引起耐药。

3 讨论

支原体缺乏细胞壁结构，作用于细胞壁的β-内酰胺类药物对其无效，而作用于蛋白质合成和DNA复制环节的大环内酯类、四环素类和氟喹诺酮类药物抗支原体效果较强[5]。本研究结果发现，福建地区分离的鸡滑液囊支原体临床株对大环内酯类药物（泰万菌素、泰乐菌素和替米考星）、截短侧耳素类（泰妙菌素）和四环素类（多西环素和土霉素）较为敏感，而抗菌药物氟苯尼考和恩诺沙星由于在兽医临床的广泛应用，鸡滑液囊支原体临床株对其敏感性降低，与国内相关调查数据较为一致。

丁美娟等2012—2014年测定自河南、江苏、安徽、河北和广东5省分离得到的鸡滑液囊支原体代表株药物敏感性，发现其对泰乐菌素较为敏感，对氟喹诺酮类药物具有不同程度的抗药性[6]。2015—2017年招丽婵等分析了广东、广西、江苏、浙江、福建等地10个不同地区鸡滑液囊支原体代表株，发现其均对泰妙菌素、泰万菌素、泰乐菌素和多西环素较为敏感，而对金霉素、庆大霉素等敏感性下降，甚至出现不同程度耐受性，对盐酸环丙沙星、沙拉沙星敏感性较低[7]。石晓磊等2017年初从宁夏地区采集87份疑似感染鸡病料，分离得到13株鸡滑液囊支原体，每个分离地随机挑选1株进行药敏试验，发现3株滑液囊支原体均对泰万菌素、泰妙菌素、泰乐菌素敏感，而对氟苯尼考和恩诺沙星有一定的耐受性[8]。Kreizinger等2002—2016年自欧洲中部和东部7个国家采集到41株鸡滑液囊支原体， 发现四环素类（多西环素、土霉素和金霉素）、大环内酯类（泰万菌素、泰乐菌素和替米考星）、截短侧耳素类（泰妙菌素和沃尼妙林）以及盐酸林可大观对其具有体外抑菌效果，而氟喹诺酮类（恩诺沙星、双氟沙星），新霉素，壮观霉素，林可霉素和氟苯尼考的MIC值较高[9]。

本研究应用Illumina Nova Seq PE150技术对多重耐药株（MS HB）进行全基因组序列分析，破解其耐药与毒力相关因子遗传信息。通过与VFDB数据库比对，挖掘到MS HB基因组中存在多个毒力相关因子，包括dnaK、cylA、EF-Tu、lplA1、SSU98、oppF、pdhB、 vlh和GAPDH等。与其他支原体相同， 如牛支原体[10]、鸡毒支原体[11]、猪肺炎支原体[12-13]等，这些毒力相关因子可参与支原体感染宿主细胞、逃避免疫并引起宿主免疫病理反应，在支原体动物体内定殖和存活中起着重要作用[14]。

通过与ARDB数据库进行比对，分析得到MS HB株基因组中存在大环内酯类抗性基因ermQ，该基因最早在产期荚膜梭菌中发现，可介导对大环内酯类-林可霉素-链阳菌素B（MLS）耐药[15]。

ermQ基因作用机制主要为编码甲基化酶，使核糖体23S rRNA基因甲基化，导致MLS失去对鸡滑液囊支原体的抑制作用。本研究首次报道在鸡滑液囊支原体基因组中检测到ermQ抗性基因。支原体对大环内酯类药物最重要的耐药机制是核糖体上23S rRNA结构域Ⅱ区和Ⅴ区靶点突变[16]。鸡滑液囊支原体基因组中包含2个rrn操纵子，每个操纵子具有1个23S rRNA基因。研究报道23S rRNA基因Ⅱ区突变位点较少，目前仅有G748A报道[17]，与其他支原体类似。Inna Lysnyansky和Katinka Beko等发现，鸡滑液囊支原体23S rRNA基因Ⅳ区最常见的靶点突变为G2057A、A2058G和A2059G[4，17]。本研究中鸡滑液囊支原体临床株（MS HB株）对大环内酯类抗生素（泰万菌素、泰乐菌素和替米考星）呈现高度耐药特征，但通过比对并未在这些常见位点检测到突变，推测其对大环内酯类主要耐药机制可能由ermQ所介导。恩诺沙星对MS HB株的MIC值与敏感标准株WVU1853相比，升高32倍。比较两者氟喹诺酮类靶酶编码基因（gyrA、gyrB、parC和parE），发现多个突变位点，可能与其耐药性相关，但需要进一步验证，其中ParC蛋白的T85I位点突变在近期文献[4]中亦有报道。

目前，抗菌药物治疗仍是国内临床防控鸡滑液囊支原体感染最有效的方法。根据本研究结果，防治鸡滑液囊支原体感染，可首选泰万菌素和泰妙菌素;而针对鸡滑液囊支原体与其他细菌性疾病的混合感染，可考虑与多西环素、氟苯尼考等抗菌药物联合用药进行防控。支原体虽然生长缓慢，培养条件苛刻，但其臨床分离鉴定与长期耐药性检测具有重要临床意义，应结合药敏试验审慎合理选择敏感药物进行治疗。未来也可针对其耐药机制建立耐药突变位点的分子生物学快速检测方法，达到预测耐药性的目的，可缩短支原体培养与药敏实验时间，亦可为临床治疗鸡滑液囊支原体感染的合理用药选择提供理论依据和实践指导。

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